番茄分子育種現狀與展望——從基因克隆到品種改良

2018.07.03

番茄起源于南美洲安第斯山脈,在墨西哥完成馴化,于16世紀傳到歐洲。除了栽培番茄,番茄屬還包含12個野生番茄種。本文從分子育種的視角對近年來在番茄分子生物學、功能基因組學等領域的研究進展做一綜述,并對番茄分子育種的發展方向進行分析和探討。

1 分子育種的界定 

在傳統的植物遺傳育種實踐中,研究人員一般基于現有的種質資源,通過有性雜交和后代的表 型選擇進行農藝性狀的轉移與改良,育種周期較長、遺傳改良效率偏低。分子育種,是指在對控制農藝性狀的關鍵基因或QTL功能認識的基礎上,將現代生物技術手段整合于傳統育種方法中,創新種質資源,提高選擇效率,實現有目標的設計育種。分子育種可大幅度提高育種效率,縮短育種年限,在提高產量、改善品質、增強抗性等方面已顯示出巨大潛力,成為現代作物育種的主要方向。 根據分子手段參與形式的不同,分子育種主要包括以下兩方面的內容。 

(1)分子標記育種。分子標記育種(又稱分子標記輔助選擇) ,利用與目標基因緊密連鎖的分子標記(或基于目標基因本身的功能標記)作為選擇標記,在育種選 育過程中,通過分子標記的篩選來完成目標性狀的選擇。分子標記輔助育種實現了由表型選擇到基 因型選擇的過渡,無論在選擇效率還是選擇精度上都比傳統選擇育種有很強的優勢。近年來,隨著 高通量分子標記檢測技術,基因組重測序和生物統計分析方法的飛速發展,可以同時對大量樣本材料進行前景選擇(目標性狀)和背景選擇(遺傳背景),大大提高了選擇的精度和效率。分子標記技 術除了應用于品種選育過程,在諸如基因聚合、回交轉育、遺傳多樣性分析、雜種優勢預測、種子 純度和真實性檢測、新品種保護等方面也顯現出巨大的應用前景。 

(2)基因組編輯育種。傳統雜交育種常受物種間生殖隔離限制和連鎖累贅的影響。以轉基因、 定向誘導基因組局部突變和基因組編輯等技術為代表的基因組編輯育種可以打破生殖隔離、連鎖累贅等因素的限制,實 現目標性狀的快速精準改良。轉基因育種是利用重組DNA技術,將功能明確的基因或DNA片段通過遺傳轉化手段導入受體品種基因組,并使其表達目標性狀的育種方法。由于克隆的基因可來自任何物種,所以轉基因育種能打破基因在不同物種間交流的障礙。TILLING 則是利用高通量突變檢測技術在人工誘變或自然群體中快速準確地鑒定出目標基因突變個體的技術方法。 基因組編輯技術是利用序列特異的核酸酶在基因組特定位點誘導產生DNA雙鏈斷裂,進而激活細胞自身修復機制,實現對基因組的精確修飾(替換、插入或缺失等)。規律成簇間隔短回文重復序列及其核酸酶系統(CRISPR/Cas9),由于編輯效率更高,操作更為簡便,成本更低,可同時對多個靶點進行編輯等特點成為當前最為主流的基因組編輯技術。CRISPR/Cas9 和 TILLING技術在功能基因組學研究、優異種質資源創制、有利等位基因挖掘以及作物定向育種等方面具有巨大的應用潛力。

從技術層面講,傳統育種是分子育種的基礎,而分子育種則是傳統育種的補充與升級。分子育種技術體系的建立很大程度上依賴于對作物農藝性狀形成的分子機制的認知。對控制重要農藝性狀關鍵基因或 QTL 的定位、克隆和功能分析可以為分子標記育種提供實用標記,為基因組編輯育種提供靶標基因。在此基礎上,利用QTL的遺傳效應、QTL之間的互作、QTL與環境之間的互作等信息模擬和預測各種可能基因型組合的表現型,最終實現有目標的設計育種。 

2 番茄主要農藝性狀形成的分子機制

番茄是研究果實發育、合軸分枝、復葉形成和抗病性的經典模式植物,上述性狀表現與其生長 發育和商品品質密切相關,因此也是研究馴化和遺傳改良的主要對象。前人已對上述專門領域相關的研究成果做了詳盡綜述。本文簡述近年來番茄主要農藝性狀形成的分子機制研究進展,重點介紹利用正向遺傳學手段克隆/定位的關鍵基因和 QTL(表 1,表 2)。

2.1 果實大小與形狀

番茄果實質量是一個典型的數量性狀,由多個基因共同控制。目前已知的控制番茄果實質量的 主效 QTL 大約有 10 個,其中 4 個已經被克隆。fw2.2 是番茄中第一個克隆的位于第 2 染色體上的控 制果實質量的 QTL,也是作物中克隆的第一個 QTL。該位點編碼一個抑制細胞分裂的膜定位蛋白,可以解釋野生番茄和普通大果番茄果實質量差異的 30%。與野生番茄相比,普通大果番茄中 fw2.2 的表達量更低,細胞分裂更活躍,胎座和中柱更大(Frary et al.,2000)。目前關于 fw2.2 調控細胞分裂活性的具體機制還不清楚。fw3.2是另外一個被克隆的位于番茄的第 3 號染色體上的果實質量 QTL,該位點編碼一個 CYP78A 亞家族的 P450 蛋白 SlKLUH,通過增加果皮和中隔組織的細胞數而使果實變大。Chakrabarti 等(2013)發現該基因啟動子中 1 個 SNP 與果實質量高度相關,這個 SNP 可 能導致 SlKLUH 表達調控元件的突變,進而使得 SlKLUH 的表達量上升和果實質量增加。與 fw2.2 和 fw3.2 不同,locule number(lc)和 fasciated(fas)主要通過增加番茄果實的心室數而使果實變大。 lc 對心室數的影響相對較小,只能把心室數由 2 個提升到 3 ~ 4 個。相比而言,fas 可將心室數提升 至 6 個,這兩個遺傳位點的上位互作可使番茄心室數達到 8 個以上,果實質量也增加一倍。Lc 位于番茄的第 2 號染色體上,Munos 等(2011)通過圖位克隆方法在 WUSCHEL 基因下游鑒定到兩個與心室數高度相關的 SNP 位點,暗示 lc 的表型可能與 WUSCHEL 有關。fas 突變是由 11 號染色體上 1 個 294 kb 染色體片段的反轉所致,一直以來人們把 fas 多心室的表型歸因于染色體片段反轉位點附 近一個 YABBY 轉錄因子基因的失活(Cong et al.,2008),最近 Xu 等(2015)認為 fas 的表型更可能是由于反轉位點附近另一個基因 CLAVATA3(CLV3)表達量降低造成的。此外,Xu 等(2015)還鑒定到另外兩個控制番茄果實心室數的位點 Fasciated and branched(FAB)和 Fasciated inflorescence(FIN),FAB 編碼 CLV3 的受體激酶 CLV1,而 FIN 編碼一個可以對 CLV3 進行翻譯后 修飾的阿拉伯糖基轉移酶。 

番茄的馴化改良除了使果實變得更大,也極大增加了果實形狀的多樣性。野生番茄果實一般為圓形,而現代栽培番茄的果實形狀各異,可以分為圓形、橢圓形、扁圓形、矩形、長形、梨形、心形和牛心形等8個類型。目前已克隆或精細定位的5個控制果形的基因 LC、FAS、OVATE、SUN 和 FS8.1 可以解釋大部分栽培番茄果形的變異。lc 和 fas 通過增加果實的心室數使果實變扁,而 OVATE、 SUN 和 FS8.1 主要控制果實的伸長。OVATE 編碼一個果實伸長的負調控因子,該基因的突變導致番茄果實呈梨形(Liu et al.,2002)。值得注意的是,并非所有含 ovate 突變的遺傳背景都呈梨形,說明 ovate 可以和基因組中其它位點互作導致梨形果實的形成。Sun 在促進果實伸長方面比 ovate 效應更強,Sun 位點突變是由于逆轉錄轉座子 Rider 介導的一個 24.7 kb 片段的重復使得 IDQ12 基因表達上升所致(Xiao et al.,2008)。fs8.1 是另一個控制果實伸長的 QTL,該位點主要控制矩形番茄(常 見于加工番茄品種)的形成,Sun 等(2015)已將 FS8.1 定位到 8 號染色體一個 3.03 Mb 的區段內, 預計很快會被克隆。就馴化進程而言,Rodriguez 等(2011)通過分析 368 份番茄種質資源中 LC、 FAS、OVATE 和 SUN 突變等位基因的分布和頻率,研究了番茄果形的馴化歷史,發現 lc、ovate 和 fas 突變發生在番茄馴化的早期,而 Sun 突變很可能是在番茄傳入歐洲以后才產生。相比而言,lc 突變的產生比 ovate 和 fas 更早。 

2.2 果實成熟 

近20年來,人們在番茄中鑒定、克隆了一系列果實成熟相關的基因,并對番茄果實成熟的遺 傳調控機制進行了深入研究。番茄是典型的呼吸躍變型果實,其成熟嚴格依賴于乙烯的合成及信號傳導。已有研究表明,果實成熟突變體 Never ripe(Nr)、Green ripe(Gr) 和 yellow fruited tomato 1(yft1)均是由于乙烯信號傳導受阻而無法正常成熟。其中 NR 編碼乙烯受體之一 LeETR3;GR 編碼擬南芥 RTE1的同源蛋白,RTE1 蛋白被報道可與乙烯受體 AtETR1 互作并修飾 AtETR1 的活性;YFT1則編碼乙烯信號途徑重要調控因子EIN2。其它一些參與乙烯合成和信號傳導的基因,如 ACS2、 ACS4、ACO、EIL1 等,也在番茄果實成熟過程中發揮重要作用。另外3個番茄突變體 ripening inhibitor(rin)、non-ripening(nor)和 Colorless non-ripening(Cnr)在果實成熟方面具有類似的特點:(1)果實不能正常成熟;(2)無法合成果實成熟必需的乙烯;(3)外源施加乙烯也不能成熟,說明這3個基因可能作用于乙烯的上游,通過依賴和不依賴乙烯的信號途徑調控果實成熟。圖位克隆分析顯示 RIN 編碼一個 MADS-box 轉錄因子,Nor 編碼一個 NAC 轉錄 因子,而 Cnr 則是一個表觀遺傳突變,該突變是由于一個 SBP 類型的轉錄因子基因啟動子區域DNA甲基化升高導致的。上述 3 個突變體除了不能合成乙烯,在果實軟化、類胡蘿卜素積累、風味物質合成等方面也受到明顯的抑制。染色質免疫共沉淀試驗顯示 RIN 可以直接調控一系列成熟相關基因的表達,包括乙烯合成相關基因(ACS2、ACS4 和 ACO1),細胞壁代謝相關基因(PG2a 和 EXP1),類胡蘿卜素合成基因(PSY1 和 PDS),風味物質合成相關基因(TomLoxC、ADH2 和 HPL)以及一些果實成熟相關的轉錄因子基因等。值得注意的是,rin 和 nor 突變體被育種家廣泛用于延長番茄貨架期和提高果實硬度,rin 主要用于大果番茄,而 nor 主要應用于櫻桃番茄。 在番茄中還鑒定到另外一些調控果實成熟的轉錄因子,如 TOMATO AGAMOUS-LIKE1 (TAGL1)、FRUITFULL(FUL1 和 FUL2)、HD-Zip homeobox protein(LeHB-1)和 APETALA2a (AP2a)。

近年來番茄果實成熟的調控網絡已基本掌握,但仍有一些關鍵問題尚待探究,例如激 活果實成熟過程的發育信號到底是什么,果實成熟過程中乙烯的大量合成是如何被開啟的,乙烯的 大量合成是果實成熟的原因還是結果。 

2.3 顏色形成 

目前番茄中已克隆多個果肉顏色發生變化的突變體,其中6個是由于類胡蘿卜素合成途徑的酶突變引起的。yellow flesh 為黃色果肉,由八氫番茄紅素合成酶基因 PSY1 突變導致;tangerine 和 fruit carotenoid-deficient 為橘黃色果肉,分別由類胡蘿卜素異構酶基因 CRTISO 和異戊烯基焦磷酸異構酶基因 IDI1 突變導致。兩個來源于野生番茄的顯性突變位點 Beta 和 Delta 也可使果肉呈橘黃色,其中 Beta 編碼番茄紅素β–環化酶,而Delta編碼番茄紅素 ε–環化酶;old gold與Beta互為等位基因,old gold功能缺失突變體 因無法合成 β–胡蘿卜素而使果肉呈深紅色。番茄白色果實突變體 lutescent 2 是由于葉綠素缺陷導致的,最近 Barry 等(2012)證明 Lutescent 2 編碼一個葉 綠體定位的鋅離子金屬蛋白酶。番茄綠果肉突變體 green flesh 是由于STAY GREEN(SGR)基因突變導致的,其果實在成熟過程中葉綠素降解不完全,與番茄紅素同時存在,使得果實顏色呈現銹紅色 到棕色甚至紫/黑色。 

質體(包括葉綠體和有色體)是合成葉綠素和類胡蘿卜素的主要場所,果實中質體大小和數量 的變化也影響番茄果實的顏色。番茄高色素突變體 high pigment 1(hp1)、high pigment 2(hp2)和 high pigment 3(hp3)中類胡蘿卜素含量的增加都歸功于質體數的增多和體積增大。HP1 和 HP2 分別編碼光信號負調控因子(UV-damaged DNA-binding protein 1,DDB1)和 DE-ETIOLATED1(DET1), 而 HP3 編碼玉米黃質環氧化酶(Zeaxanthin epoxidase,ZEP)。番茄果實中葉綠體的發育和葉綠素的分布主要受 Uniform ripening(U)位點 的控制。U 編碼一個 MYB 轉錄因子 Golden 2-like 2(GLK2),GLK2 在果實中的梯度表達使番茄果肩呈深綠色。GLK2 的功能缺失(u)使果實整體顏色呈均勻淡綠色(無深綠色果肩),葉綠體發育 受損,成熟果實中色素和糖的積累降低。長期以來,在人們追求番茄果實均勻 著色的育種實踐中,U 位點受到了強烈的選擇,現代栽培番茄中很多品種因不含有功能性 GLK2而無法形成綠色果肩。盡管這種選擇使得番茄果實著色更加均勻,但選擇的代價就是番茄的品質受到 很大影響。與 u 類似,另一個番茄果色突變體 uniform gray-green(ug)的未成熟果實也無綠肩。近期的研究表明UG編碼一個KNOX轉錄因子TKN4,TKN4作用于 GLK2 的上游調控番茄果實中葉 綠素的梯度分布。 

普通紅果番茄的果皮為黃色,主要是由于柚皮素查耳酮等物質的積累所致。在粉果番茄中,果 皮因無法積累柚皮素查耳酮等物質而使得果實整體顏色呈現為粉色。Yellow 決定著果皮中柚皮素查耳酮等物質的積累與否,盡管前期研究表明 Yellow 編碼一個 MYB 轉錄因子 SlMYB12,但導致該基因在粉果中失活的變異位點一直不清楚。最近,中國科學家通過全基因組關聯分析發現 SlMYB12 啟動子區域一個 603 bp 缺失導致該基因表達下降是粉果形成的主要原因。大多數栽培番茄果皮中并不積累花青素,但野生番茄 Aubergine (Abg)、Anthocyanin fruit(Aft)和 atroviolaceum(atv)等位點的滲入重新賦予栽培番茄合成花青 素的能力,使其果皮中積累花青素,形成紫色番茄。目前 ABG、AFT 和 ATV 還未被克隆,有證據顯示 AFT 可能編碼花青素合成途徑中的調控因子 SlANT1 或 SlAN2。 

2.4 風味品質及單性結實 

現代栽培番茄的風味品質下降主要是由于野生抗病位點滲入導致的連鎖累贅,貨架期延長帶來的負面效應以及 uniform ripening 的應用等。番茄果實的風味品質是復雜的數量性狀,受到糖、酸, 糖酸比,揮發性化合物以及果實質地等因素的影響。Brix9-2-5 是一個重要的控制番茄果實可溶性固形物含量的QTL位點,該位點最初在潘那利番茄 LA0716 和番茄栽培種 M82 組配的漸滲系群體中被發現。Brix9-2-5能使葡萄糖含量提高 28%,使果糖含量提高 18%,其編碼一個質外體蔗糖轉化酶 Lin5,主要負責將蔗糖水解為果糖和葡萄糖。普通栽培番茄果實主要含果糖和葡萄糖,基本不含蔗糖;而綠果野生種番茄果實含有蔗糖。Chetelat 等(1995)從野生番茄克梅留斯基(S. chmielewskii)LA1028 中鑒定到一個調節成熟果實中蔗糖含量的主效QTL位點 Sucr (Sucrose accumulator)。SUCR 編碼一個液泡型蔗糖轉化酶,Sucr 位點可以提高成熟果實中的蔗糖、 總糖和可溶性固形物含量。此外,人們在多毛番茄 LA1777 中發現了一個可以增加未成熟果實淀粉含量和成熟果實可溶性固形物含量的基因 AGPL1(H),AGPL1 編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的大亞基。目前克隆的與番茄風味品質相關的基因還包括控制果實揮發性物質合成的 AADC、LoxC 和 CXE1(Klee & Tieman,2013)以及控制果實質地的 EXP1、PG2a 和 PL 等。 

單性結實育種是現代番茄育種密切關注點之一。目前已報道的控制番茄單性結實的基因位點有8個:pat、pat2、pat3/pat4、pat4.1/pat5.1 和 pat4.2/pat9.1。比較有利用價值的兩個資源材料為 ‘Severianin’(pat2)和‘RP75/79’(pat3/pat4),主控基因均為隱性。目前這些單性結實基因均未被克隆。生長素和赤霉素在調控番茄單性結實方面發揮重要作用。生產上人們通常利用生長素類似物 2,4-D 蘸花提高番茄的坐果率(人工單性結實),而 pat、pat2、pat3/pat4 單性結實的性狀均是由于子房內赤霉素含量增加所致。研究表明,生長素和 赤霉素信號途徑中的一些基因的突變或沉默也可誘發番茄的單性結實,如 ARF7、ARF8、IAA9 和 DELLA 等。




2.5 株型和花序結構 

番茄莖的分枝模式為典型的合軸分枝,其整個生長發育一直伴隨著營養生長和生殖生長狀態的相互轉換。SELF-PRUNING(SP)是控制番茄合軸生長階段從營養生長向生殖生長轉換的重要開關。SP 基因的突變并不影響番茄的開花時間(第一花序前的葉片數),卻導致合軸單元內葉片數的逐步減少直至兩個連續花序出現而封頂。sp 突變體表現為花序間葉片數變少、花序數變少以及植株變矮。這種有限生長類型的番茄植株緊湊、果實成熟期一致、利于果實的機械化收獲。SP編碼CETS蛋白家族的一個成員,通過拮抗該蛋白家族另一個成員 SINGLE FLOWER TRUSS(SFT)的活性抑制開花信號。SFT 編碼番茄的開花信號分子成花素 (florigen),SFT 主要在葉片中表達,可以運輸到莖頂端誘導花芽的分化。sft 功能缺失突變體表現為開花延遲(15 ~ 20片葉后才形成第一個單花)、主莖生長停止后規律性的合軸單元生長模式被打破,取而待之的是由單花和葉片組成的營養型花序。sft 單突變體和 sft/sp 雙 突變體表型類似,說明 sp 自封頂的效應需要功能性 SFT 的存在。SFT(促進開花)和 SP(抑制開 花)在調控營養生長向生殖生長轉換的過程中發揮重要作用,通過遺傳操作調整二者所介導的開花 信號的強度,可以改變番茄的株型和產量。Krieger 等(2010)發現在有限生長類型(sp- /-)的番茄中,sft 處于雜合狀態時(sft– /+,sp– /–)可降低開花信號,抑制sp突變體過早封頂而導致花序數增多和產量大幅度提高,證明 SFT 是番茄中一個超顯性雜種優勢基因。水稻和擬南芥中的研究表明,由成花素、14-3-3 蛋白和 bZIP 轉錄因子組裝形成的成花素激活復合體(florigen activation complex, FAC)可通過調控一些花分生組織特性基因的表達促進花分生組織的形成,進而誘導開花,這種機制在番茄中也是適用的。Park 等(2014)在篩選 sp 抑制突變體的過程中鑒定到FAC復合體中bZIP轉錄因子SSP的兩個突變體 ssp-2129 和 ssp-610。這兩個突變體由于影響 FAC 復合體的正常組裝導致開花信號的減弱,將sp有限生長類型恢復成無限生長類型,但合軸單元內葉片數(2 片)較普通無限生長類型少,最終導致番茄花序的密度增大。這種新型的無限生長類型番茄在提高產量和縮短番茄收獲期方面具有很大的應用價值。此外,把 SFT 和 SSP 不同突變類型以雜合體狀態組合在sp背景中也可以大幅度提高番茄的產量。 

由葉腋分生組織發育形成的側枝對番茄的株型和產量有重要影響,生產上通常采用摘除側枝等措施進行整枝以實現增產的目的。目前已知的控制番茄側枝形成的基因主要有 LATERAL SUPPRESSOR(LS)、BLIND(BL)和 BRANCHED1(BRC1a/b)。ls 和 bl 突變體中側枝均不能正常形成,不同的是 ls 僅抑制主莖營養生長時期(第一花序之前)側枝的形成,而 bl 突變體中合軸分生組織的形成也被阻止,導致合軸單元無法正常形成,花序形成后即封頂。LS 編碼一個 GRAS 家族的 VHIID 轉錄因子,而 BL 則是 R2R3 類 MYB 轉錄因子家族的一員。遺傳分析顯示 LS 和 BL 可能通過不同的途徑調控葉腋分生組織的形成。BRC1a/b 是擬南芥 BRANCHED1 的同源基因,編碼 TCP 類型的轉錄因子,在抑制番茄側芽外生方面發揮重要作用。BRC1a/b 主要在主莖休眠的葉腋分生組織中表達,而不在合軸分生組織中表達,說明主要 控制主莖側芽的外生。BRC1b 的沉默可促進主莖側芽的外生,而 BRC1a 的效果不明顯,這可能與栽培番茄中BRC1a的表達更低有關。Martin-Trillo等(2011)發現含有潘那利番茄 BRC1a 基因的漸 滲系 IL3-5 中 BRC1a 的表達比其野生型 M82 高 4 倍,側芽的外生也顯著減少,暗示栽培番茄中 BRC1a 表達量的下降以及側芽更易外生可能是馴化選擇的結果。 

與莖的發育模式類似,番茄花序也遵循合軸發育的模式。番茄突變體 compound inflorescence(s)、 anantha(an)和 falsiflora(fa)均表現為高度分枝的花序結構。所不同的是,an 和 fa 由于成花能力的喪失,使得側生合軸花序分生組織無限制地形成,導致花椰菜型花序(an)和營養型花序(fa)的形成;而s突變體仍能成花,只是花序分生組織向花分生組織的轉化速度變慢,每產生 2 ~ 4 個合軸花序分生組織才能形成一個花,最終導致復狀花序的形成,栽培番茄中絕大多數復狀花序均由于S基因突變導致。S編碼 WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 9(WOX9),而AN和FA分別編碼一個 F-box 蛋白 UNUSUAL FLORAL ORGANS(UFO)和轉錄因子 LEAFY。S 主要在初生花序分生組織中表達,控制其向花分生組織的轉化;而 AN 和 FA 主要在花分生組織表達,控制花分生組織的形成。與s、an和fa不同,早花突變體 terminating flower(tmf)的花序結構為單式花。tmf 突變體中AN和FA等花分生組織決定基因在莖端分生組織過早表達,從而喪失了形成新的合軸花序分生組織的能力。TMF編碼 ALOG(Arabidopsis LIGHT-SENSITIVE HYPOCOTYL 1,Oryza G1)蛋白家族的一個成員,在莖頂端表達,主要功能是維持營養生長而防止過早成花。番茄果梗無離層突變體 jointless(j)由于一個 MADS-box 基因突變導致花序形成1 ~ 3朵花后便轉回營養生長。J 主要在花序分生組織表達, 防止其轉回營養生長以及防止其向花分生組織過早轉化。如前所述,番茄晚花突變體 sft 和 fa 均不同程度地表現為營養型花序,說明成花信號在莖端 分生組織和合軸花序分生組織中抑制營養生長的機制是通用的。 

2.6 花器官發育與雄性不育 

番茄花器官由同心圓的四輪結構:第一輪萼片、第二輪花瓣、第三輪雄蕊和第四輪心皮組成。 Coen 和 Meyerowitz(1991)提出了控制花器官發育的ABC模型:A類基因在第一、二輪花器官中 表達,B類基因在第二、三輪花器官中表達,而C類基因則在第三、四輪花器官中表達。A類基因單獨決定萼片的形成,A 類和 B 類基因聯合控制花瓣的形成,B類和C類基因共同決定雄蕊的形成,C類基因單獨調控心皮的形成,A類與C類基因相互抑制。之后人們將D類基因和E類基因加入ABC模型,擴展為ABCDE模型。 

人們已在番茄中鑒定到多個控制花器官形成的同源異型基因。MACROCALYX是擬南芥A類基因 AP1 的同源基因,該基因突變導致葉狀萼片的形成。番茄B類基因有 Tomato MADS box gene 6(TM6)、Tomato APETALA3(TAP3)、Tomato PISTILLATA(TPI)以及 TPIB。其中番茄無雄蕊突變體 stamenless 是由于 TAP3 突變導致的。 番茄中尚未發現 C 類基因發生突變的突變體,但人們通過反向遺傳學手段證明 C 類基因 TOMATO AGAMOUS 1(TAG1)在雄蕊和心皮的發育過程中發揮重要作用。此外,番茄中鑒定到的影響花器官形成的同源異型基因還有 TM5、TM4、TAGL1、TAGL2、TAGL11 和 TAGL12 等。 

目前番茄中已發現的雄性不育材料主要分為結構不育(如無雄蕊突變體)、功能不育(如花藥不開裂和長花柱突變體)和小孢子不育(包括40余份花粉敗育的突變體材料)等 3 類。這其中已克隆的雄性不育基因除了前面提及的 Stamenless,還有 Positional sterility-2(Ps-2)、Style 2.1、Male sterile10-35(Ms10-35)等。其中,Ps-2 編碼一個多聚半乳糖醛酸酶,控制花藥開裂;Style 2.1 編碼一個包含螺旋—環—螺旋結構(HLH)的轉錄因子,控制花柱的伸長;Ms10-35 編碼一個與擬南芥 DYSFUNCTIONAL TAPETUM1 (DYT1 )和水稻 UNDEVELOPED TAPETUM1(UDT1)同源的 bHLH 轉錄因子,控制雄蕊的減數分裂和絨氈層發育。由于這些雄性不育材料各有優缺點,限制了其廣泛應用。對現有其它雄性不 育材料的基因克隆以及利用轉基因、基因編輯等技術創制新型雄性不育材料將會大大推動雄性不育 系在番茄雜交制種中的應用。 

2.7 復葉發育 

目前已發現并克隆的葉形相關突變體可大體分為兩類:一類使葉的復雜度降低,另一類使葉的復雜度增加。第一類突變體包括 potato leaf(c)、trifoliate(tf)、Lanceolate(La)、goblet(gob)、 entire(e)以及 procera(pro)。C 編碼一個 R2R3 MYB 轉錄因子,與側枝形成調控因子 BLIND(BL) 高度同源,該基因的突變導致番茄葉片復雜度降低,與馬鈴薯葉形類似。TF 同樣編碼一個 R2R3 MYB 類型的轉錄因子,該基因的突變不但影響番茄復葉中小葉的形成,還抑制葉腋處側芽的形成。C 與 TF 的克隆暗示番茄葉形與側枝形成的調控機制具有一 定的保守性。LA 編碼 TCP 轉錄因子家族的一員,該基因的編碼區含有一個 microRNA319 的結合位點,該結合位點的堿基變化導致 LA 轉錄本更穩定(表達量更高),使得葉片呈披針形;最近的研究表明LA通過直接調控MADS box基因MBP20和TM4的表達調控復葉發育。NAC轉錄因子基因 GOBLET 突變導致番茄子葉融合在一起呈高腳杯狀,真葉的復雜 程度也大大降低,表現為初級小葉葉緣更加平滑、不能形成二級小葉等特點。goblet 突變體中葉復雜度的降低主要是由于小葉的融合引起的。研究表明生長素途徑負調控因子 IAA9 突變導致 entire 突變體的葉形幾近簡單葉,盡管 IAA9 調控復葉發育的分 子機理還不清楚,但從側面反映出生長素在復葉發育過程中的重要性。赤霉素(GA)負向調控番茄葉的復雜度,外源施加 GA,或赤霉素途徑抑制子 DELLA 蛋白的突變(procera),都使得番茄僅能 形成葉緣平滑的初級小葉。 

另一類突變體,如 Mouse ear(Me)、Curl(Cu)、bipinnata(bip)、Peteroselinum(Pts)等使番茄葉的復雜度增加。Me 是在栽培番茄品種 Rutgers 中發現的一個葉復雜度增加的顯性突變體,可以形成 3 ~ 4 級的小葉,與過量表達KNOXI基因TKN2/LeT6的轉基因番茄類似。分子檢測顯示該突變體的表型是由于 PFP(編碼焦磷酸依賴性磷酸果糖激酶的β亞基)與 TKN2 基因融合引起的 TKN2 表達量升高所致。另一個顯性突變體 Cu 也是由于 TKN2 異常表達所致。KNOXI 蛋白的活性會受到 BELL 家族蛋白的調控,番茄 BELL 家族成員 BIPINNATA (BIP)可以與 TKN2 互作,并影響 TKN2 的亞細胞定位。bip 突變體葉的復雜性增加,并伴隨另一 個 KNOXI 基因 TKN1 的表達上調,表明 KNOXI-BIP 互作抑制 KNOXI 的活性。 S. galapagense 來源的顯性突變 Pts 同樣導致 TKN1 的表達上調和葉復雜度增加。PTS 編碼一個缺少同源異型結構域的新型 KNOX 蛋白,PTS 可以干擾 TKN2 與 BIP 的互作。Kimura 等(2008)認為 Pts 突變體中 PTS 的過量表達抑制 TKN2-BIP 互作,使得 TKN2 的活性得以釋放,導致葉復雜度增 加。上述結果說明 KNOXI 基因表達及活性的精細調控對復葉的發育至關重要。另外兩個已克隆的使葉復雜度增加的突變體是 clausa(clau)和 lyrate(lyr)。研究表明,CLAU 編碼一個 MYB 轉錄因子,通過影響細胞分裂素信號途徑促進復葉分化;而 LYR 編碼一個鋅指蛋白,通過正調生長素信號及負調 KNOXI 基因表達發揮作用。David-Schwartz 等(2009)認為復葉與單葉的形態差異可能與進化導致的 LYRATE 表達差異有關。

2.8 對病蟲害的抗性及其它 

現代栽培番茄品種抗病基因或位點大多來源于野生番茄。早在 20 世紀 30 年代,人們就嘗試將 醋栗番茄(S. pimpinellifolium)抗葉霉病基因轉入栽培番茄。迄今為止,大約有 30 個主要抗病蟲害 的基因或 QTL 被克隆或精細定位。這其中,抗細菌/真菌病害基因 Prf、I-2、Ph-3 與抗病毒病基因 Tm22 、Sw-5 以及抗線蟲基因 Mi-1.2、Hero 均屬于典型的 NBS-LRR 類抗病基因,暗示植物在抵抗不同生物脅迫時采用類似的防御策略。番茄與細菌性斑點病致病菌(Pseudomonas syringae)以及葉霉病致病菌(Cladosporium fulvum)的互作是研究植物抗病分子機制的模式系統,近年來相關領域的研究進展使人們對這兩種病原菌的致病及番茄抗病機理有了更深入的認識。相比而言,人們對于番茄與其它病原菌、昆蟲互作的分子機制的了解較少,很多研究僅限于對抗病基因的定位與克隆,一些病害甚至尚未鑒定到有效的抗源或主效抗病位點。由于病蟲害抗性多是受單基因或主效位點控制的質量性狀,抗病育種已成為分子標記輔助將野生番茄有利位點導入栽培番茄最成功的領域。盡管如此,野生番茄抗病位點滲入所帶來的連鎖累贅限制了番茄的進一步改良,分析這些滲入片段的長度和在基因組中的精確位置有利于將連鎖累贅的限制降至最低。 

目前已克隆的番茄其它農藝性狀相關的基因或QTL還包括耐受持續光照的 chlorophyll a/b binding protein 13(CAB-13)、控制花粉單向不親和性的 Unilateral incompatibility1.1(Ui1.1)和 Ui6.1、 控制種子大小的 Seed weight 4.1(Sw4.1)、控制表皮毛發生的 Woolly(Wo)以及抑制寄生植物大花 菟絲子生長的 CUSCUTA RECEPTOR 1(CuRe1)等。

3 番茄分子育種現狀 

3.1 番茄分子標記育種現狀 

番茄是最早構建遺傳連鎖圖譜的作物之一,也是最早進行圖位克隆和 QTL 定位的作物之一。 早在 1992 年,Tanksley 等(1992)就構建了番茄第一張高密度遺傳連鎖圖譜。此后,人們利用栽培番茄和不同野生番茄的分離群體構建了多張分子遺傳圖譜,極大推動了QTL的定位、克隆以及分子標記在番茄遺傳改良中的應用,涉及的基因包括:抗細菌性斑點病基因 Pto,抗青枯病基因 Bwr-12, 抗瘡痂病基因 Rx-3,抗枯萎病基因 I、I-2 和 I-3,抗葉霉病基因 Cf-2、4、5、9,抗灰葉斑基因 Sm, 抗晚疫病基因 Ph-2 和 Ph-3,抗黃萎病基因 Ve,抗煙草花葉病毒基因 Tm-22 ,抗黃化曲葉病毒基因 Ty-1、Ty-2 和 Ty-3,抗斑萎病毒基因 Sw-5,抗根結線蟲基因 Mi-1.2,遲熟基因 Rin 和 Nor,綠果肩基因 U 以及自封頂基因 Sp 等。除了輔助選擇育種,人們還利用分子標記技術進行番茄基因聚合育種。Gur 和 Zamir(2004)將來自 S. pennellii 的 3 個染色體片段聚合到加工番茄品種 M82 中,育成了 IL789 品系。在濕潤和干旱條件下,IL789 雜合體均可顯著提高產量(Gur & Zamir,2004)。Hanson 等(2016)綜合利用分子標記輔助選擇和表型鑒定等方法對番茄抗晚疫病基因 Ph-2 和 Ph-3、抗黃花曲葉病基因 Ty-1、抗青枯病基因 Bwr-12、抗枯萎病基因 I2、抗煙草花葉病毒基因 Tm-22 以及抗灰 葉斑基因 Sm 進行聚合,獲得了 5 份兼抗6種病害的育種材料。番茄基因組測序完成后,科學家們利用基因組重測序和高通量分子標記技術對番茄馴化和改良的進化歷史進行了研究。Lin 等(2014)對來自世界各地的 360 份番茄種質資源進行重測序分析,構建了單核苷酸分辨率的番茄變異組圖譜, 解析了番茄馴化和育種的基因組歷史,結果支持櫻桃番茄(Solanum lycopersicum var. cerasiforme) 是由醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)馴化而來,而普通大果番茄則是由櫻桃番茄進一步改良而來。此外,Lin 等(2014)還發現番茄的馴化、改良以及野生資源的利用共導致了約 25%(200 Mb) 的基因組區域被固定,利用常規手段很難再對這些區域進行改良。 

野生資源優良性狀的轉育存在著諸多障礙,如雜交不親和、F1 雜種不育、分離世代不育、種間重組率降低導致的連鎖累贅等,這些障礙使得野生資源利用主要集中在單基因控制的抗病、抗蟲性狀。利用野生資源改良產量、品質、抗逆性的難度較大,因為這些性狀的遺傳方式復雜,受 QTL 互作和 QTL 與環境互作等因素影響,難以從表現型推斷基因型,選擇效率也必然降低。Eshed 和 Zamir (1994)提出用分子標記輔助選擇手段構建覆蓋整個野生種基因組的漸滲系群體(Introgression lines, ILs)來克服上述限制。漸滲系群體是由供體(野生種)和受體(栽培種)雜交后進行多次回交并輔 之于分子標記選擇,最后再自交產生的。理想的漸滲系群體應該覆蓋供體的全部基因組,而且每個個體只含有供體的單一染色體片段。番茄是最早用分子標記輔助選擇構建單片段漸滲系的作物,也是目前應用漸滲系進行 QTL 研究和野生資源利用最深入的作物。Eshed 和 Zamir(1994)以潘那利番茄(S. pennellii)材料 LA716 為供體,以栽培番茄 M82 為受體構建了番茄中第一套 IL 群體,這 套 IL 群體最初由 50 個漸滲系組成,每個漸滲系含有由 RFLP 標記界定的來自 S. pennellii LA716 的 染色體單片段。Liu 和 Zamir 等(1999)從這 50 個系中又再次分解了 26 個新的漸滲系。這套包含 76 個漸滲系的 S. pennelli IL 群體已經被廣泛應用于番茄產量、果實品質、耐生物和非生物脅迫等性 狀的 QTL 定位與分析。最近,Alseekh 等(2013)利用 COSII 和 SSR 等標記將其中 37 個包含較大 S. pennellii 染色體片段的漸滲系進一步分解,獲得了 285 個新的漸滲系,可以覆蓋 S. pennellii 基因 組的 75%,這套高分辨率的 IL 群體為微效 QTL 的定位以及 QTL 的互作分析提供了新的遺傳工具。此外,近年來人們借助分子標記輔助選擇手段構建了多套栽培番茄和野生番茄(如 S. habrochaites, S. chmielewskii,S. lycopersicoides,S. pimpinellifolium 等)雜交產生的漸滲系或回交自交系群體,這 些群體被廣泛應用于基因的精細定位、QTL 的遺傳效應分析以及野生番茄優良性狀的篩選與利用。 

3.2 番茄基因組編輯育種現狀

自 20 世紀 80 年代末期,人們開始利用轉基因技術對栽培番茄進行遺傳改良。1994 年,美國 Calgene 公司研發的轉基因耐貯番茄 FLAVR SAVR 被批準在美國上市,成為全球首例商業化生產的 轉基因作物。FLAVR SAVR 的研發思路是通過調控多聚半乳糖醛酸酶的表達,延遲番茄軟化過程,從而延長其貨架壽命,達到耐貯藏的目的。中國的華中農業大學亦在 1990 年開始轉基因耐貯藏番茄的研發,在 1996 年獲農業部農業生物基因工程安全委員會批準,成為中國首個批準的可商品化生產的農業生物基因工程產品。該轉基因產品是將乙烯合成酶的反義基因導入到番茄中,抑制乙烯的合成,達到延熟的效果。利用該轉基因材料選育的耐貯藏雜種一代番茄于1998年通過了湖北省農作物 品種審定委員會審定,定名為‘華番 1 號’,商品名為百日鮮,成為中國首個農作物基因工程品種。除了耐貯藏番茄,人們還利用轉基因技術創制了各種抗病、抗蟲、抗除草劑、單性結實和品質得以改良的番茄新種質。例如,Butelli 等(2008)將金魚草中的兩個轉錄因子基因Delila和Rosea1導入番茄,獲得了果皮和果肉均大量積累花青素的紫色番茄,罹患癌癥的小鼠食用這種紫色番茄后壽命顯著增加,說明這種轉基因番茄可能具有抗癌的功效。盡管近年來轉基因番茄的研究發展迅速,但由于公眾對轉基因安全性的疑慮以及其它原因,目前轉基因番茄的推廣應用處于低谷狀態。

與轉基因育種相比,TILLING(定向誘導基因組局部突變)和基因組編輯技術不涉及轉基因安全性問題。Mazzucato 等(2015)利用 TILLING 技術在人工誘變的加工番茄 Red Setter 突變體庫中鑒定到1份 IAA9 基因的突變材料 iaa9-618,與野生型 Red Setter 相比,iaa9-618 單性結實率大幅度提高,可應用于單性結實育種。Minoia 等(2016)采用類似的策略鑒定到兩份 EXP1 基因發生突變的番茄材料,這兩份材料顯著提高了果實硬度。以 CRISPR/CAS9 為代表的基因組編輯技術是近年來分子育種領域的熱點技術。與 TILLING 相比,該技術無需構建突變體庫,可在 1 ~ 2 年時間內實現核心親本目標性狀的快速改良;而與傳統回交育種相比,CRISPR/CAS9 又不存在連鎖累贅等問題,理論上可對基因組中的任意基因進行操作。番茄中已有應用 CRISPR/CAS9 技術對基因組進行編輯的報道,Xu 等(2015)利用該技術對 CLV3 進行基因編輯,使得番茄果實的心室數顯著增加;Uluisik 等(2016)通過對 PL 進行編輯顯著提高了果實的硬度。該技術在番茄重要農藝性狀改良方面具有巨大的應用潛力,例如可以利用該技術對紅果番茄品種中控制類黃酮合成的 MYB12 基因進行敲除, 創制粉果番茄;對控制番茄紅素合成的 HP1 基因進行敲除,創制高番茄紅素番茄;對控制綠肩形成 的 U 基因進行敲除,創制無綠肩的番茄新種質等等。 

4 展望:中國番茄分子育種發展的幾點建議 

4.1 建立高效的分子育種組織體系和技術體系 

作物分子育種體系中,從種質資源搜集到新基因發掘,再到品種培育及其產業化,是一個完整的鏈條。強大的育種產業必須是從上游到下游的創新鏈條,各環節協同分工,目標一致。在美國和歐洲的跨國公司里,盡管各個環節各有其不同的重點研發內容,培育突破性新品種并實現產業化的目標貫穿始終,各環節間實現無縫鏈接,形成了“基礎研究、標記開發、基因克隆、遺傳轉化、品種培育、產品推廣”的完整產業技術研發體系。

在中國,目前的作物分子育種隊伍較為分散,零星存在于農業大學和科研機構,產業和研發集中度太低,低水平重復嚴重,各單位之間相對封閉,技術和材料交流不暢,不能有效地凝聚成合力。 同時,中國缺少大規模高效率的國家級分子育種平臺,致使分子育種效率較低。由此可見,除了加強對作物分子育種的經費資助強度外,中國需要創新作物分子育種組織實施機制。例如,鼓勵種子企業從事分子育種,建立一流生物技術企業的孵化機制;建立知識產權保護和資源共享機制,建立上中下游結合,產學研用聯合的實施機制,實行政府引導,企業主導和市場運作的產業化運行模式等。具體到番茄種業來說,可以以中國園藝學會番茄分會或中國番茄種業聯盟為組織框架,整合各科研院所、種業公司的優勢力量和資源(包括人才、種質、技術、設備和資金資源),建立公共的分子育種技術平臺、種質資源創新平臺、種子質量檢測平臺、生物信息分析平臺等,聯合開展種質原始創新、技術集成創新和品種自主創制,研發高端番茄品種,打造繁育推一體化、產供銷一條龍的 番茄生產鏈體系,推動中國番茄種業向前發展。 

4.2 重視種質資源評價、創制及野生資源利用 

優異種質資源的創制是育種的核心動力。中國從事番茄育種研究的各級科研院所、大學以及種子公司有上百家,每家各自擁有數百甚至上千份番茄種質資源和育種材料,保守估計全國引種保存的番茄原始材料已超過10000份,育種材料更是數不勝數。但是由于缺乏對這些種質資源的遺傳多樣性分析、精準表型鑒定和基因型鑒定,每份種質資源中所含的基因和等位基因變異尚不清楚,不同等位基因的頻率、分布和效應更無從得知,這已成為開發標記、克隆基因和設計品種的瓶頸。因此,應盡快組織國內番茄遺傳、育種資源的搜集和整理工作,在此基礎上利用分子標記技術對這些資源進行系統的基因型和遺傳多樣性分析,構建番茄雜種優勢群,這對于了解中國番茄育種材料的遺傳多樣性具有重要意義。立足目前國內外優良雜交種的基礎上,根據生產需求和育種發展的前景,構建復合雜交群體應用于自主知識產權的核心自交系的創制,這對于培育自主知識產權的突破性番茄品種具有極高的應用價值。 

栽培番茄基因組中僅包含野生番茄總遺傳變異的5%,因此野生資源的利用對于拓寬栽培番茄的遺傳多樣性以及實現突破性品種的選育至關重要。目前已構建了多套栽培番茄和野生番茄雜交產生的漸滲系群體。引入這些野生資源漸滲系,并通過分子標記技術將外源有利等位基因導入栽培番茄,將極大拓寬番茄種質資源的遺傳多樣性,并在提高產量、改善品質、增強抗性等方面發揮巨大作用。除了野生番茄,番茄“傳家寶”資源(heirloom)在親緣關系上遠離現代番茄栽培品種,其園藝學特征和品質特性表現出更豐富的遺傳多樣性,搜集和利用這些遺傳資源對栽培番茄品質改良具有潛在的應用價值。 

4.3 加強對重要農藝性狀形成的分子機制的研究 

番茄分子育種技術體系的建立很大程度上依賴于人們對控制重要農藝性狀的關鍵基因或 QTL 功能的認知。迄今為止,人們已經克隆或精細定位了 100 余個番茄農藝性狀相關的基因和 QTL。但目前可通過分子育種技術改良的性狀大多是受單基因控制的質量性狀。對于復雜的農藝性狀(如風味品質和非生物脅迫抗性等),由于缺乏對其分子遺傳基礎的認識,分子育種目前還難有作為。另外,本文所述的絕大多數基因的專利權都掌握在國外種業公司和科研機構手中,這嚴重限制了中國番茄分子育種的發展。因此,應持續加大對分子育種相關基礎和應用基礎研究的投入,深入研究番茄品 質和非生物脅迫抗性等性狀形成的遺傳和分子基礎,快速克隆一批具有自主知識產權的有利用價值的新基因,闡明基因在種質資源中的各種等位變異類型及其遺傳效應,為分子標記育種、基因組編 輯育種和分子設計育種提供標記、基因和其它遺傳信息。 

4.4 關注分子育種新技術新方法的發展和應用 

除了本文所述的分子標記技術和基因組編輯技術,目前國際上普遍使用或正在發展的分子育種技術還包括新一代測序技術、全基因組選擇技術、MutMap、雙單倍體育種、轉基因嫁接、反向育種、 寡核苷酸引導的突變、RNA 介導的 DNA 甲基化等技術,這些新育種技術的應 用以及生物信息統計分析方法的飛速發展將推動作物遺傳育種進入一個嶄新的時代。 

因此,應重視對分子育種新技術新方法的發展、創新和應用,不斷促進中國分子育種的技術升級和產業發展。育種過程的信息化管理是現代化商業育種的重要特征之一,國際知名育種公司已建立了高效的育種信息化管理平臺。相比而言,國內種業在育種數據的采集、管理、匯總、分析和利用上明顯落后和低效。因此,應盡快推進番茄育種的信息化管理進程,圍繞新品種選育的實際過程,以性狀數據采集和處理分析為核心,以育種過程管理為基礎,實現對育種的信息化管理和數據的科學化分析,全面提高中國番茄育種的管理水平和育種效率。  

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